看见生命的微妙瞬间：高灵敏度CCD相机，活体成像的理想选择

图1 活体成像应用方向

可见光成像技术主要分为荧光和生物自发光两种，两种成像方法的原理如下图。

图2 荧光成像与生物自发光成像原理^[1]

荧光成像利用一定波长的可见光激发荧光物质，可以发射出比激发波长更长的荧光。生物自发光成像则是利用荧光素在荧光素酶的催化下消耗ATP，并与氧气反应，发射出一定波长的荧光射线。

从上图可以看出，在使用荧光成像时，生物组织也会在外部光源的激发下发出自发荧光以及光散射，对成像造成干扰。自发荧光主要集中在可见光波段，可以通过对荧光物质进行修饰，将荧光发射波段延伸到近红外区域，减少自发荧光的产生，提高成像质量和成像深度。自发光成像不需要外部光源，并且没有荧光素的生物组织部分不会发光，所以没有背景光影响。在亮度低的情况下，信噪比反而更高，适合观察微弱的生物信号^[2]。

2004年, Tamara Troy 等人对荧光成像和自发光成像的强度进行了研究，通过给同一只小鼠左侧注射HeLa-luc/PKH26 细胞，右侧注射HeLa-luc细胞，分别实现荧光成像和自发光成像。结果表明荧光信号比自发光信号高了两个数量级，但是较高的背景自发荧光大大地降低了信噪比。基于他们所使用的探测器，生物发光只需要900个细胞就能被检测出来，而荧光至少需要1.5x105个细胞积累的信号才能大于背景荧光。

图3 荧光与自发光发射光信号的强度与信噪比^[2]

良好的成像质量是获取细胞、生物体特征状态或特征分子分布等信息的关键，那么在探测器的选择上就需要考虑到如何在弱信号，长时间曝光等情况下获得高质量的图像：

• 灵 敏 度：正如前面提到的可见光成像产生的光信号非常微弱，尤其是生物自发光应用，如果探测器的灵敏度不足，则采集不到足够辨识的光信号，难以获得高信噪比的成像结果，导致检出限高。
  

• 量子效率：CCD相机的量子效率（Quantum Efficiency, QE）与灵敏度息息相关。量子效率指传感器能够将入射光子转化为电子的效率，量子效率越高，相机能够探测到的光子就越多。工业级的CCD相机通常只具有50%的量子效率，而科研级的CCD相机可以实现90%以上。

• 噪 声：同样由于信号较弱，因此探测器背景噪音的大小至关重要，特别是在长时间曝光的情况下，传感器内部由于随机热运动而产生的噪声，即暗电流(e-/pixel/s)，将会逐渐积累，甚至会淹没有用信号。而低温可以抑制传感器内部的热运动，降低暗电流，其随温度的变化可以由下图参考。暗电流偏大也是不在这类应用下使用CMOS相机的原因。

图4 暗电流与温度的关系

• 动 态 范 围：需要宽动态范围来捕获同一图像内的弱信号与强信号，避免出现在长时间曝光后，弱信号还没有检测到，强信号就已经饱和。

因此，具有高灵敏度、低噪声、高动态范围的科研级CCD探测器是实现高质量活体成像系统的关键核心部件。

2020年南锡自动化研究中心（CRAN）研究团队报道了基于生物自发光成像和X射线成像联合的活体成像系统optiMAX（如图5）^[3]。该系统主要由X射线源、反射镜、荧光屏和CCD四部分组成，实现了最小0.2 mm的图像空间分辨率。如图6展示了不同荧光素浓度条件下的U87-Luc2恶性胶质瘤细胞的生物自发光成像结果，可以看到，即便使用的荧光素浓度只有20 μg/mL，曝光时间只有90s，U87-Luc2细胞也可以清晰地被观测到。这主要得益于具有高灵敏度和深度制冷的科研级CCD探测器。

图5 基于生物自发光成像和X射线成像联合的活体成像系统optiMAX

图6 U87-Luc2细胞在不同荧光素浓度和细胞数量条件下的生物自发光成像结果

• 可以实现-100℃的深度制冷，暗电流噪声低至0.0005 e-/pixel/s，即使在长时间曝光下也可以确保实现极佳的信噪比。

• 可以选择多种传感器类型以及抗反射涂层，在大多数荧光素酶的发射波长以及近红外波段范围内具有超过95%的QE，如图7，可以检测到非常微弱的光子信号。

图7 ELSE相机近红外增强的QE

• 满井容量高达120,000 e-，可以在长时间曝光采集弱信号的情况下，确保强信号不饱和，实现高动态范围成像。

• 具有18bit的AD转化器位数，可以充分利用CCD传感器的整个动态范围，以实现最高的检测性能和信噪比。

• 可以进行灵活的像素合并操作，具备多种触发和同步模式，具备裁剪与连拍模式，可通过软件选择增益，进行温度监控。

下图为使用greateyes ELSE 1024 1024 DD NIR相机对小鼠淋巴结中的癌细胞进行成像检测。

图8 小鼠活体成像

将具有癌细胞特异性的荧光染料注入小鼠体内，通过外部光源激发产生荧光。左侧为老鼠的光散射图像，右侧则展示了光散射与对淋巴结肿瘤组织中积累的荧光标记染料进行荧光检测的叠加图像，大鼠头部周围的荧光信号是由于毛皮的自发荧光所引起的。

活体成像在生物医学研究中具有重要意义，能够实时、无创地观察体内动态过程。荧光与自发光成像信号微弱，要求探测器具备高灵敏度、低噪声和高动态范围。greateyes的ELSE系列相机凭借超低暗电流、超过90%量子效率和宽动态范围，能够满足这两类成像的需求，是理想的成像工具。

 greateyes成立于2008年，以德国柏林洪堡大学的技术为基础，开发、生产并销售高性能科学相机，被广泛应用于成像与谱学应用领域。

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[1] Kim S J, Lee H Y. In vivo molecular imaging in preclinical research[J]. Laboratory Animal Research, 2022, 38(1): 31.

[2] Troy T, Jekic-McMullen D, Sambucetti L, et al. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models[J]. Molecular imaging, 2004, 3(1): 15353500200403196.

[3] Joël D., Justine J., Alicia C., Hervé S., Sophie P., Imaging Performance of a Multimodal Module to Enhance Preclinical Irradiator Capabilities. Clin. Oncol. Res., 2020, 3(2).

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